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應用熒光顯微鏡研究了蛋白質在氣-水界面的組裝——材料和方法
來源：上海謂載 瀏覽 1951 次 發布時間:2021-12-14
2.實驗材料和方法
第二節一般試劑。對于所有步驟，均使用去離子水（去離子水，Mar Cor優質混床去離子，25°C時電阻率為18.2 MΩ3 cm）。通過在去離子水中溶解適量的NaH2PO4和NaN3，然后用1 M HCl調節pH至7.2，制備用于熒光顯微鏡的磷酸鹽緩沖鹽（PBS）溶液；在整個研究過程中，最終濃度為10 mM磷酸鹽和30 mM NaN3。PBS的離子強度通過添加NaCl來調節。Pluronic F-127（Invitrogen，MW～12 500）用PBS稀釋至0.010 mg/mL作為儲備溶液。二硫蘇糖醇（DTT）購自Fisher Scientific。
通過熒光顯微鏡對AWI處的蛋白質組裝進行成像。如圖1A所示，HSA-TR在一個特殊設計的密封室中成像，其中蛋白質水相（體積10μL，厚度100-200μm）與一層厚度也為100-200μm的空氣共存。該室由聚二甲基硅氧烷組裝而成，并用聚乙二醇（MW 5000）對覆蓋玻璃進行改性，以減少蛋白質在固液界面上的競爭吸附。（參見支持信息中的樣品室和表面改性以及圖S1。）在該室中形成的AWI與顯微鏡臺形成的XY平面平行。與之前對圓形液滴成像的嘗試相比，這有助于界面成像。通過在界面處聚焦（稱為XY平面圖像）或以0.1μm/步的步長垂直于界面掃描（稱為XZ平面圖像），收集了23,30張圖像。使用Olympus IX81倒置顯微鏡獲取共焦圖像。表觀熒光圖像由耦合到奧林巴斯IX81系統的高光譜CCD（CRi Nuance FX）相機捕獲。物鏡（40，浸水，1.15 NA）通過使用543 nm激光或帶有530-550 nm帶通激發濾光片的汞燈激發染料，從下方對樣品溶液成像。在575-655nm范圍內收集發射。光漂白后熒光恢復（FRAP）實驗在同一共焦顯微鏡上進行，帶有奧林巴斯SIM掃描儀裝置。使用100%功率的351 nm激光在AWI處對蛋白質層的小區域進行20 s的光漂白。使用543 nm激光（停留時間為2μs/像素）在光漂白之前、期間和之后捕獲區域的共焦圖像。使用ImageJ軟件對圖像進行分析。31
圖1。（A）樣品室和倒置顯微鏡設置。（B-G）在AWI條件下，pH 7.2，離子強度=193 mM的PBS中HSA-TR的共焦圖像。（B，C）HSA-TR（0.050 mg/mL）或（D，E）HSA-TR（0.025 mg/mL）的XY平面圖像。圖像C和E使用4倍光學變焦。穿過（F）HSA-TR（0.050 mg/mL）或（G）HSA-TR（0.025 mg/mL）AWI的XZ平面圖像。比例尺：20μm。
蛋白質標記。商用HSA（Sigma-Aldrich）用胺反應性熒光團Texas Red-X琥珀酰亞胺酯（Invitrogen）標記。首先將Texas Red-X溶解在二甲基甲酰胺（10 mg/mL）中，然后緩慢添加少量該濃縮染料溶液，同時攪拌至蛋白質水溶液（0.1 M NaHCO3緩沖液中的2 mg/mL HSA，pH 8.3）。混合后染料與蛋白質的摩爾比為10:1。用鋁箔覆蓋反應溶液，并在室溫下連續攪拌1h。然后通過10-DG柱（Bio-Rad）運行反應溶液，去除未反應的染料。用PBS洗脫標記的蛋白質，并在4°C下，在9 krpm下，用3 kDa截止分子量離心過濾裝置（微孔）進一步濃縮和純化30 min，并用10 kDa透析盒（Thermo Scientific）對1 L 10 mM磷酸鹽緩沖液透析1周。以牛血清白蛋白（BSA，Thermo Scientific）為標準，通過Lowry分析（Thermo Scientific）測定標記蛋白的最終濃度。紫外-可見光譜和MALDI-TOF質譜顯示標記的染料與蛋白質的比率分別為1.3和1.5。（參見支持信息中的染料與蛋白質比率測量和圖S2。）將產品溶液分成等份，并在-20°C下儲存以供進一步使用。
染料標記和未標記蛋白質的比較。通過圓二色譜（CD）光譜和表面壓力測量對HSA和HSA-TR進行比較。將AWI處標記或未標記蛋白質形成的蛋白質層轉移到云母表面，并使用敲擊模式AFM（數字儀器）測量高度，并使用Nanoscope IIIa軟件（5.12版，數字儀器）進行處理。
CD測量在帶有珀耳帖溫度控制器的Chirascan CD光譜儀上進行。在10mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）中，用10mM NaCl將HSA和HSA-TR稀釋至0.10mg/mL，然后轉移至0.1cm路徑長度的試管中。HSA和HSA-TR的遠紫外CD光譜在25°C下收集，波長范圍為190-260 nm，掃描速率為0.5 nm/s，狹縫帶寬為1.0 nm。在25℃和95℃之間記錄熱變性曲線，每一步增加2℃和120 s平衡時間。使用帶有線探針微量天平的MicroTroughX-Langmuir槽測量表面壓力（Kibron，Inc.）。將10mM PBS中的HSA或HSA-TR（0.10mg/mL）用移液管移到微槽中。在AWI立即形成后1小時內記錄表面壓力。然后，使用Langmuir-Schaefer技術，通過Kibron微槽控制器，將AWI處的層轉移到新劈開的云母表面上。32使用去離子水進行沖洗步驟，以沖洗掉樣品表面上多余的鹽。樣品在空氣中干燥，然后在空氣中使用超銳懸臂梁（NSC16，MikroMasch）在攻絲模式下通過AFM進行研究。使用WSxM軟件（Nanotec）分析AFM圖像以確定膜厚度。33
應用熒光顯微鏡研究了蛋白質在氣-水界面的組裝——結論、致謝！