采用表面張力、界面張力、熒光、動態(tài)光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）等方法，研究了由Bacillus subtilis HSO121所產(chǎn)生的一組表面活性素的膠束化行為。通過對表面活性素溶液表面張力、表面活性素對水/正己烷界面張力的影響、表面活性素膠束微極性以及膠束粒徑和形態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)隨著表面活性素脂肪鏈長度的增加，其表界面活性增強，溶液中趨向于形成更大的聚集體。

1引言

表面活性素（surfactin）是脂肽家族中一類具有代表性的生物表面活性劑。脂肽是由微生物在細(xì)胞表面或者由胞外分泌產(chǎn)生的一類由脂肪酸和肽組成的具有兩親結(jié)構(gòu)的化合物，是優(yōu)良的生物表面活性劑?？莶菅挎邨U菌（Bacillus subtilis）產(chǎn)生的脂肽主要有表面活性素（surfactin）、地衣素（lichenysin）、伊枯草素（iturins）和豐原素（fengycin）等。表面活性素在1968年由Arima等1鑒定命名，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由Kakinuma等確定為含有7個α-氨基酸和β-羥基脂肪酸構(gòu)成的環(huán)狀脂肽類化合物。表面活性素可以在1×10-5mol·L-1濃度時，將水的表面張力由72 mN·m-1降低到27 mN·m-1,是表面活性最強的一類脂肽。另外表面活性素還表現(xiàn)出特殊的生物活性，如抗病毒、抗腫瘤、抗真菌、抗HIV和溶血等。表面活性素的這些表面和生物活性與它在水溶液中的物理化學(xué)性質(zhì)有著密切的關(guān)系，因此研究表面活性素溶液的性質(zhì)以及膠束化過程對于進(jìn)一步探索表面活性素的生物物理活性以及拓展其在化學(xué)工業(yè)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的意義。

表面活性素的自身結(jié)構(gòu)，脂肪鏈和氨基酸部分的不同，對表面活性素的物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性都會產(chǎn)生一定的影響。Gallet等14用分子模擬的方法研究了脂肪鏈長度為13、14、15的表面活性素同系物在親水/親油界面上的不同構(gòu)型。Razafindralambo等用動態(tài)表面張力法研究了脂肪鏈長為13、14、15的表面活性素，發(fā)現(xiàn)隨著鏈長的增加，動態(tài)界面張力降低得更快。Song等用LB膜技術(shù)研究了烴鏈長度對表面活性素界面形態(tài)的影響。Deleu等計算模擬了表面活性素和生物膜的作用，Eeman等研究了烴鏈長度為13、14、15的環(huán)狀表面活性素以及烴鏈長為15的直鏈表面活性素，都發(fā)現(xiàn)鏈長的增加大大加強了表面活性素的表面活性，同時也影響著表面活性素和磷脂膜的相互作用。因此系統(tǒng)研究表面活性素分子結(jié)構(gòu)對其溶液性質(zhì)的影響，對表面活性素的化學(xué)和生物應(yīng)用都有一定的指導(dǎo)意義。

目前，對表面活性素溶液性質(zhì)的研究已有一些報道，但是基于分離純化技術(shù)的限制，大多數(shù)研究都是針對表面活性素同系物及其類似物的混合體系。這樣得到的結(jié)果難以準(zhǔn)確地表征表面活性素膠束化過程以及表面活性素溶液體系的各個參數(shù)，而且各個研究結(jié)果之間差異較大，結(jié)果不穩(wěn)定。本文由一株枯草芽孢桿菌HSO121出發(fā)，發(fā)酵培養(yǎng)及分離純化得到了5種主要表面活性素，通過表面張力、界面張力、熒光法、動態(tài)光散射（DLS）和冷凍刻蝕電鏡（FF-TEM）對不同結(jié)構(gòu)的表面活性素溶液膠束化行為比較，得到表面活性素結(jié)構(gòu)差異對其溶液性質(zhì)和膠束化行為的影響規(guī)律。

2實驗部分

2.1表面活性素的制備以及分離純化

實驗所用的表面活性素樣品由本實驗室分離鑒定的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis HSO121培養(yǎng)產(chǎn)生。表面活性素粗提物用常壓反相柱（YMC ODS C18柱，Φ3.0 cm×10 cm,50μm）純化，去除色素。然后再由高效液相色譜（JASCO LC-2000,日本，HIQ sil C18W柱，Φ21.2 mm×250 mm,5μm），采用甲醇、水體系進(jìn)一步分離，得到各個表面活性素的組分，如圖1所示。

圖1表面活性素的分析型高效液相色譜圖

得到的脂肽先由氨基酸自動分析儀獲得脂肽的氨基酸組成，然后用電噴霧四極桿~飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ESI Q-TOF MS/MS）和氣相色譜/質(zhì)譜連用（GC/MS）對脂肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

實驗所用的表面活性素樣品結(jié)構(gòu)如圖2所示，脂肪酸鏈碳數(shù)分別為12、13、14、15、16。

2.2試劑

KCl,分析純，上海凌峰試劑有限公司；正己烷，分析純，上海菲達(dá)工程有限公司；使用0.05 mol·L-1,pH為8.5的Tris（Gene-Tech,純度＞99.95%）緩沖溶液；水為二次重蒸水。

2.3實驗方法

2.3.1表面張力的測定

配置一系列濃度的表面活性素水溶液，0.05 mol·L-1Tris緩沖液，pH 8.5,25°C,用表/界面張力儀及動態(tài)接觸角分析系統(tǒng)DCA315（Thermo Cahn,美國）測定其表面張力。

2.3.2界面張力測定

固定表面活性素濃度為4×10-5mol·L-1,用旋滴界面張力儀TX-550A型（芬蘭Kibron）測定了各個不同結(jié)構(gòu)的表面活性素對于水和正己烷的油水界面張力的影響。由TX-550A旋滴界面張力儀測得表面活性素水溶液中正己烷液滴的長度L（cm）和寬度D（cm），計算得到界面張力。當(dāng)L/D≥4時，可根據(jù)式（1）計算液液界面張力：

圖2表面活性素結(jié)構(gòu)圖

式中γ為界面張力（mN·m-1），Δρ為兩相密度差（g·cm-3），Z為儀器上顯示的旋轉(zhuǎn)周期（ms·2π-1），K為常數(shù)0.3817.當(dāng)L/D＜4時，可根據(jù)式（2）計算：

式中f為校正參數(shù)，由不同的L/D值對應(yīng)得到。

2.3.3熒光法

表面活性素溶液的膠束微環(huán)境性質(zhì)由熒光分光光度計F-4500（Hitachi,日本）測定，采用芘（Sigma-Aldrich,99%（w））作為熒光探針。在激發(fā)光波長為335 nm時，芘的熒光發(fā)射光譜在350-500 nm有5個特征峰，其中第一峰的熒光強度I1在極性溶劑中呈現(xiàn)出較大的增加，第三峰的熒光強度I3在非極性溶劑中較強，其強度隨條件變化不大，因此I1與I3之比值強烈依賴于環(huán)境極性。23測定芘在不同結(jié)構(gòu)表面活性素溶液（4×10-5mol·L-1）的熒光光譜，研究表面活性素結(jié)構(gòu)對其膠束微環(huán)境性質(zhì)的影響。

2.3.4動態(tài)光散射

通過激光粒度儀Nano-ZS（Malvern,英國）測定了不同結(jié)構(gòu)表面活性素溶液中膠束粒徑的分布，樣品槽溫度恒定在25°C,表面活性素濃度為4×10-5mol·L-1.

2.3.5冷凍刻蝕電鏡

將樣品滴入樣品杯內(nèi)并迅速投入液氮（約77 K）中冷凍固定。在液氮環(huán)境下，樣品杯轉(zhuǎn)移到樣品座上，然后送入冷凍蝕刻儀BALZERS BAF-400D（Bal-tec,列支敦士登）的真空腔中（真空腔中的樣品臺及冷刀預(yù)冷到約100 K）。取出樣品桿，抽真空。等到系統(tǒng)壓力小于1×10-9Pa時，將樣品斷裂。以45°角向樣品斷裂面噴鍍厚約2 nm的鉑，然后以垂直方向噴鍍1-20 nm的碳層。取出樣品，重蒸水漂洗，用銅網(wǎng)將復(fù)型撈起，晾干后，用透射電子顯微鏡JEM-1400（JEOL,日本）觀察。

圖3不同鏈長表面活性素溶液的表面張力圖