摘要

精子結(jié)合蛋白（BSP）是牛精漿中的主要蛋白質(zhì)，已知其部分插入精子膜的外小葉，并與其中存在的含膽堿脂質(zhì)結(jié)合。這種插入通過誘導(dǎo)精子早期獲能，對冷凍保存后的精液質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。BSP蛋白表面性質(zhì)的假設(shè)通過張力測定法進行了驗證：BSP蛋白具有高度的表面活性。這表明BSP蛋白不僅通過相互之間的相互作用，而且由于其自身的表面活性，能夠到達磷脂覆蓋的界面。BSP蛋白插入精子外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域是在類似Langmuir單分子膜的仿生系統(tǒng)上復(fù)制的。BSP蛋白的插入可以在含有膽堿脂質(zhì)的可壓縮流體域中進行。單層膜也被用來研究BSP蛋白與兩種磷脂組裝物的絡(luò)合作用：蛋黃低密度脂蛋白（LDL）或雞蛋磷脂脂質(zhì)體。無論磷脂結(jié)構(gòu)（脂蛋白或脂質(zhì)體）如何，BSP都不能改變膜的結(jié)構(gòu)。只有BSP蛋白與磷脂酰膽堿的總比例是重要的。這兩種螯合劑的區(qū)別在于它們的表面性質(zhì)：LDL有很強的與外層結(jié)合的傾向，而脂質(zhì)體主要以相同的時間尺度保持在本體中。

1、介紹

精子結(jié)合蛋白（BSP）是一個已知在輸卵管精子儲存庫的形成和精子獲能中起作用的蛋白質(zhì)家族，精子成熟是受精的關(guān)鍵步驟[1,2]。在牛精漿中，根據(jù)Manjunath等人的命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和BSP5[6,7]分別鑒定和分類了三種比例為10:1:1的主要BSP蛋白[3]。BSP1和BSP3的表觀質(zhì)量為15–16.5 kDa，BSP5的表觀質(zhì)量為28–30 kDa[6,8]。這三種蛋白質(zhì)由一個獨特的N端結(jié)構(gòu)域和兩個纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域組成。只有三種BSP蛋白的N端結(jié)構(gòu)域存在顯著差異[4–6]。每個纖維連接蛋白II型結(jié)構(gòu)域包含一個磷酰膽堿結(jié)合位點[9–14]。最后這些是BSP蛋白的生物學(xué)作用所必需的。事實上，精子膜的外小葉在射精過程中與含有BSP蛋白的精漿接觸[2,15]。BSP蛋白與精子膜上的含膽堿磷脂（如磷脂酰膽堿和鞘磷脂）快速結(jié)合[9,12,16–19]，并通過部分插入精子質(zhì)膜的外小葉[1,13,20]覆蓋精子表面。這是通向輸卵管精子儲存庫和精子獲能的第一個關(guān)鍵步驟。BSP蛋白既可溶又能插入疏水膜的事實證明BSP蛋白具有兩親性。因此，本研究的第一部分旨在通過進行張力測量來檢驗這一假設(shè)。

BSP蛋白誘導(dǎo)的早期獲能[21,22]對冷凍保存后的精液質(zhì)量有負面影響，因為它會導(dǎo)致抗冷性和抗凍性的喪失[12,17,23–25]。因此，保護器的存在對維持精子質(zhì)量至關(guān)重要。蛋黃被廣泛用于分離BSP蛋白[17,26–32]。這種隔離是由于蛋黃中存在的低密度脂蛋白（LDL）外層的磷脂酰膽堿與BSP蛋白之間的特異性和強相互作用[9,12,33,34]。在某些情況下，還假設(shè)低密度脂蛋白對精子早期獲能的保護作用是由于富含磷脂的低密度脂蛋白極性脂質(zhì)與由于外排而減少的脂質(zhì)和膽固醇的精子膜之間的交換[29]。目前，大豆卵磷脂等其他磷脂被用作蛋黃磷脂的替代品。然而，在這種情況下，脂質(zhì)體和膜之間可能的相互作用尚不清楚。因此，本研究的第二部分旨在比較低密度脂蛋白和脂質(zhì)體與脂膜接觸的行為。為此，在空氣-緩沖液界面上的脂質(zhì)單層被用來模擬精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域。這種方法被證明能有效地復(fù)制牛精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的異質(zhì)結(jié)構(gòu)域[35]。最后一種是主要的脂質(zhì)成分，即鞘磷脂、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC）和血漿鹵素1-（1Z-十八烯基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（P-PC）。在這一單層中，膽固醇和鞘磷脂在34°C處由PC和P-PC的液體混合物包圍，形成凝聚結(jié)構(gòu)域?C.LDL和脂質(zhì)體在接近生物膜相關(guān)壓力的情況下被引入單層下方的亞相[36]。通過監(jiān)測表面積的變化來檢測添加劑與單層膜之間的相互作用。最后，在相同的精子膜外小葉脂質(zhì)模型和相同的條件下，比較了LDL和脂質(zhì)體對BSP蛋白的隔離特性。

2、材料和方法

2.1.材料

主要構(gòu)成重構(gòu)膜外小葉的脂質(zhì)購自Avanti Polar Lipides（美國阿拉伯斯特市阿拉伯斯特市），并按接收時使用。化合物1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，純度>99%）和1-（1Z-十八烷基）-2-二十二碳六烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，純度>99%）作為氯仿溶液（10mg-mL）獲得?1).將PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的儲備溶液稀釋至1.25 mg mL?1解決方案。以綿羊毛膽固醇（Chol，Mw=711.0，純度>98%）和雞蛋鞘磷脂（SM，Mw=386.7，純度>98%）為粉末。二者均以1.25 mg/mL的濃度溶解于氯仿（HPLC級，法國瓦爾德魯伊爾Carlo Erba）?1.

低溫保護培養(yǎng)基由Trizma堿（173.0 mM）、一水合檸檬酸（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素（青霉素G鈉391 mg L）組成?1，硫酸鏈霉素856 mg L?1，鹽酸林可霉素204 mg L?1，硫酸大觀霉素四水合物585 mg L?1）（西格瑪-奧爾德里奇，法國圣昆廷法拉維爾）。將pH值調(diào)整為6.2，其滲透壓約為1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據(jù)Moussa等人的方案，從蛋黃中提取低密度脂蛋白（LDL）[31]。提取后，將低密度脂蛋白濃縮提取物（22±0.5 g，相當(dāng)于8.36 g干低密度脂蛋白）在低溫保護介質(zhì)（100 mL）中稀釋。通過micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，F(xiàn)rance）對LDL樣品中的蛋白質(zhì)進行定量，得出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣品中PC磷脂的含量是根據(jù)雞蛋中PC的自然比例（18.4 g PC/100 g干LDL）計算得出的，Givenbyonton等人[33]。它等于15.4克升?1份低密度脂蛋白樣品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一頭Prim Holstein公牛身上收集牛精子，并立即以10000×g離心兩次，以回收上清液中的精漿。我們樣品的蛋白質(zhì)含量為88.5±5.0mg-mL?1，由micro BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，法國）測定。

2.4.脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體由冷凍保護緩沖液中的卵磷脂提取物通過使用Avanti Polar Lipides（美國阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州阿拉巴馬州）的微型擠出機擠出而制備。卵磷脂提取物由磷脂酰膽堿（73%）和磷脂酰乙醇胺（11%）以及甘油三酯和鞘磷脂等次要成分組成。提取物在低溫保護緩沖液中水合過夜，脂質(zhì)濃度分別為3.90 mg-mL?1（C1），7.28毫克/毫升?1（C2），14.56毫克/毫升?1（C3）和21.84毫克/毫升?1（C4）。然后在超聲波浴中對分散液進行15分鐘的超聲波處理（Elmasonic S 30H，來自德國Singen Elma，功率為275W）。最后，在擠出機中擠出分散體（20次穿過100 nm的膜）。分布尺寸集中在120nm，Zeta電位值為?6毫伏。在BSP存在下引入的脂質(zhì)體量以重量表示（脂質(zhì)體分散體C1、C2、C3和C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和6.55 mg的脂質(zhì)）。不確定度為0.01 mg。

2.5.電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在還原條件下進行。將精漿溶解在pH值為6.8的緩沖液中，該緩沖液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍0.4%組成，以獲得1mg mL?1解決方案。添加9%巰基乙醇v/v，并旋轉(zhuǎn)樣品，隨后在95℃下加熱?C 5分鐘。然后，將10?L低范圍分子量標準品（法國Souffelweyersheim Euromedex公司的試劑盒O6U-0511）和10至25?L精漿裝入15%聚丙烯酰胺凝膠（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）中，并與由Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩沖液耦合。在20 mA時進行電泳，并用考馬斯藍溶液G250對凝膠進行染色。最后對染色凝膠進行掃描，并使用Multi-Gauge軟件（2.0版，日本富士照片膠片有限公司）評估峰值強度。

2.6.表面活性測量

吉布斯膜（由精漿溶液擴散到空氣-緩沖界面形成）的表面張力在安裝在朗繆爾天平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬蘭）上的15孔板（帶特氟隆邊緣的鋁底多孔板）上測量，該天平配有高靈敏度傳感器（使用合金絲的Wilhelmy方法）。該裝置被放置在一個溫度控制區(qū)，固定在23°C?C，并用純蒸餾水（美國密理博公司Milli-Q系統(tǒng)）校準。測量精度為0.1 mN/m。將精漿放入第一個孔中，然后在下一個孔中用因子2稀釋，依此類推（每個孔的體積為300?L）。每種精漿提取物重復(fù)測量4次（n=2）。結(jié)果表示為所有測量的平均值。

蛋白質(zhì)膜的壓縮等溫線是在之前配備傳感器的朗繆爾槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）上測量的。精漿首先在冷凍保存緩沖液（1/100）中稀釋，并在緩沖液表面逐滴（50?L）擴散。平衡20分鐘后，在室溫下（23℃）記錄壓縮等溫線?C）。

2.7.精子膜外小葉脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的重建

精子膜外小葉的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域如前所述重建[35]。朗格繆爾槽（302LL，NIMA技術(shù)，英國）被插入一個自制的手套箱上，放置在抗振動臺上，用氬氣沖洗，以避免脂質(zhì)氧化。表面壓力的測量精度為0.1 mN/m，使用濾紙制成的一塊極板（英國肯特郡邁德斯通惠特曼國際有限公司生產(chǎn)的無灰惠特曼色譜紙）與電子天平相連。環(huán)境溫度固定在20℃?C.將所有燒瓶和注射器放入手套箱中，然后在攤鋪單層之前用氬氣將手套箱脫氣1小時。朗繆爾天平的溫度由設(shè)置為40℃的循環(huán)水系統(tǒng)進行恒溫控制?C.緩沖液表面的實際溫度為34℃?C.亞相由低溫保護介質(zhì)組成。以適當(dāng)?shù)哪柋龋?1:14:16:39）將膽固醇、鞘磷脂、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的氯仿溶液用25?L微型注射器（精確到0.5?L）逐滴地分散到緩沖液亞相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單層保持平衡10分鐘，然后以40 cm2/min的屏障速度開始壓縮。一旦達到目標壓力（25 mN/m），通過調(diào)整可移動屏障的表面積保持壓力恒定。由于單分子層在30 mN/m時不夠穩(wěn)定，這是與雙層中脂質(zhì)堆積密度相關(guān)的膜壓力[36]，我們將目標壓力降低到25 mN/m，其中單分子層更穩(wěn)定（見結(jié)果）。

一旦達到目標壓力（25 mN/m），將其保持1000 s，然后使用彎曲針管將生物分子（LDL、BSP或脂質(zhì)體）溶液引入亞相。針頭彎曲遠離針尖，并位于槽的底部，以便在壓縮的亞相下方進行注射。之前將當(dāng)量體積（每種添加劑0.3 mL）移到屏障后面。注射生物分子后，監(jiān)測每個脂質(zhì)分子的面積變化，并表示為相對于初始值的變化（a/a=（a?A（t0）×100/A（t0）。它已經(jīng)被跟蹤了3000秒，相當(dāng)于冷凍保存前處理精液的時間。在這種恒壓模式下，生物分子插入脂質(zhì)單層導(dǎo)致膜壓力增加，而膜壓力通過增加表面積而降低。相反，如果生物分子導(dǎo)致脂質(zhì)單層溶解在亞相中，表面積就會減小。重復(fù)所有數(shù)據(jù)，偏差不超過表面積的5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使用低溫插入式低溫固定裝置（美國加坦）制備用于低溫TEM觀察的試樣，其中一滴水懸浮液沉積在輝光放電多孔型碳涂層格柵（美國Ted Pella公司）上。然后，通過將含有試樣的液滴吸干到支撐碳膜孔上殘留的薄層液體上，制備TEM網(wǎng)格。通過將格柵快速插入液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，使液膜玻璃化。玻璃化標本安裝在Gatan 910標本架（美國Gatan）中，使用CT-3500-cryotransfer系統(tǒng)（美國Gatan）將其插入顯微鏡中，并用液氮冷卻。然后從保存在玻璃質(zhì)冰中并懸浮在支撐碳基質(zhì)上的孔中的標本獲得TEM圖像。

在低劑量條件下觀察樣品（<10 e?/A2），在?178?C、使用JEM 1230“Cryo”顯微鏡（日本Jeol），在80 kV電壓下運行，并配備LaB6燈絲。所有顯微照片均記錄在Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機上。為確保觀察的良好重復(fù)性，從幾個樣品制備中采集了一系列超過50張的圖像，放大率不同。